ПРИЧИНЫ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА СПЕРМАТОЗОИДОВ (АФК\ROS тест)

Активные формы кислорода (АФК), или reactive oxygen species (ROS), являются метаболитами кислорода и включают супероксид-анион, перекись водорода, гидроксильные и гидропероксильные радикалы и оксид азота.

Когда АФК присутствуют в сперме в избытке, они могут инициировать патологические изменения сперматозоидов, вызывая окислительное повреждение клеточных липидов, белков и ДНК. Такие нарушения получили названия оксидативный стресс (ОС) сперматозоидов.

За счет снижения подвижности, нарушения акросомной реакции, повреждения рецепторов сперматозоидов ОС приводит к снижению вероятности наступления беременности. Вызывая разрывы (фрагментацию) ДНК сперматозоидов ОС приводит к нарушению развития зародыша, что сопровождается замершими беременностями, выкидышами на ранних сроках, аномалиями развития и возникновением злокачественных новообразований у детей.

Человеческий сперматозоид очень восприимчив к оксидативному стрессу.

ОС сперматозоидов оказывает отрицательное влияние, как на прогноз естественного зачатия, так и на результаты вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в т.ч. ИКСИ.

Согласно Рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (WHO-2010), Европейской ассоциации репродукции человека и эмбриологии (ESHRE-2016) и Европейской урологической ассоциации (EAU-2017) определение АФК входит в перечень рекомендуемых методов обследования при мужском бесплодии и нарушениях развития беременности.

Анализы	Цена
Продукция активных форм кислорода в нативной сперме	1355	Записаться на прием
Продукция активных форм кислорода отмытыми сперматозоидами	2678	Записаться на прием
Оценка количества формазанов в сперматозоидах	2000	Записаться на прием
Антиокислительная активность спермы	2142	Записаться на прием

F​ Оксидативный стресс сперматозоидов имеет место в 30-80% (по нашим данным около 40%) случаев при бездетном браке.

Факторы риска ОС сперматозоидов многочисленны:

​ инфекционно-воспалительные процессы в органах мочеполового тракта;

​ варикоцеле;

​ крипторхизм;

​ перегревание при лихорадочных состояниях, или действии внешних источников тепла (сауна, горячая ванна и др.);

​ психо-эмоциональные стрессы;

​ аутоиммунные реакции против сперматозоидов, сопровождающиеся выработкой антиспермальных антител (АСАТ);

​ системные заболевания (диабет, подагра и др.);

​ курение;

​ возраст старше 40 лет;

​ нехватка антиоксидантов в пище;

​ генетические дефекты системы антиоксидантной защиты.

Для оценки ОС сперматозоидов в научных исследованиях могут применяться различные тесты: прямые методы определения АФК (хемилюминесценция, NBT-тест), или непрямые методы оценки повреждений, возникших в результате ОС (определение изопростана, малонового альдегида и др.).

Единственный метод оценки оксидативного стресса, рекомендованный ВОЗ-2010 для клинических целей – метод люминолзависимой хемилюминесценции, который используем мы.

В этой процедуре применяется чувствительный люминометр для измерения малых количеств света, генерируемого сперматозоидами человека, в присутствии хемилюминесцентного зонда, такого как люминол. Описанная в Руководстве ВОЗ-2010 и используемая нами методика основана на применении смеси люминола и пероксидазы хрена для проведения чувствительных измерений образования перекиси водорода.

Примеры записи люминолзависимой хемилюминесценции эякулятов различных пациентов

(кривые I-IV).

В эякуляте человека АФК продуцируются сперматозоидами, незрелыми клетками сперматогенеза и лейкоцитами. Один лейкоцит может генерировать по меньшей мере в 100 раз больше АФК, чем сперматозоид.

Различные модификации метода применяются для оценки функциональной активности лейкоцитов и непосредственно ОС сперматозоидов.

В нашей лаборатории в настоящее время применяют три метода оценки ОС на основе хемилюминесценции:

-​ определение АФК в нативном эякуляте, что отражает суммарную продукцию АФК, зависящую в значительной степени от концентрации лейкоцитов и активности воспалительного процесса;

-​ оценка продукции АФК отмытыми сперматозоидами (на 10 млн. клеток), что отражает выраженность внутриклеточного ОС;

-​ определение антиокислительной емкости семенной плазмы, что служит основанием для назначения антиоксидантов.

Семенная плазма обладает свойствами связывать избыточную продукцию АФК, но активность антиоксидантных ферментов может быть у некоторых мужчин недостаточной. Для характеристики антиоксидантной емкости спермы используется специальная методика с использованием сульфата железа.

Запись хемилюминесценции модельной системы, генерирующей АФК (кривая М), и модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением 0,1мл спермоплазмы пациентов I, II, III, IV (кривые I-IV).

Доктор мед. наук, профессор В.А.Божедомов

Несколько цитат о роли активных форм кислорода (АФК/ROS):

-​ «…Высокое производство ROS может вызывать перекисное повреждение и потерю функции спермы, а также повреждение ДНК, как в ядерном, так и в митохондриальном геномах…»

по WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen / Editor-in-chief Dr. Trevor G. Cooper - 5th ed. 2010: 132.

-​ «… Оксидативный стресс является одной из ведущих причин повреждения спермальных ДНК…»

По C.Celik-Ozenci, G.Huszar // Male infertility. S.J.Perekatti, A.Agarwal (Eds.). Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2012: 462.

-​ «…Считается, что от 30% до 80% случаев мужского бесплодия связаны с повреждающим действием окислительного стресса на сперму, и 1 человек из 20 будет страдать из-за этого от субфертильности…»

Showell M.G. et al. Antioxidants for male subfertility (Review). Copyright © 2014 The Cochrane Collaboration. Published by JohnWiley & Sons, Ltd.

-​ «…Повышение уровня ROS, связанное с лейкоцитоспермией, может вести к повреждению клеточных мембран, внеклеточных протеинов, органелл и спермальных ДНК…»

По Smelov V.// Prostatitis and its management. T.Cai, T.E.B.Johansen (Eds.).-Springer Cham Heidelberg New York Dordrecht London, 2016: 123.

1 Системная красная волчанка (СКВ) является классическим аутоиммунным заболеванием, в патогенезе которого ведущую роль играют гиперпродукция цитотоксических аутоантител к ДНК, формирование иммунных комплексов с их последующей фиксацией под базальной мембраной эпидермиса и в стенках мелких сосудов, а также процессы апоптоза. В развитии органных поражений при этом заболевании особое значение имеет увеличение продукции фагоцитами активных форм кислорода (АФК), обладающих высоким гистодеструктивным действием. В доступной литературе мы не нашли работ относительно особенностей продукции активных форм кислорода (АФК) ключевыми клетками острого и хронического воспалительного процесса - циркулирующими нейтрофилами и моноцитами при суставном синдроме у больных СКВ.

Нами исследована продукция АФК нейтрофилами (Нф) и моноцитами(Мн) с помощью тестов люминолзависимой и люцигенинзависимой (спонтанной и индуцированной убитым стафилококком) хемилюминесценции (ХЛ), отражающих соответственно продукцию высокотоксичных активных форм кислорода (АФК) в системе миелопероксидазы и супероксиданиона у 66 больных СКВ, а также у 22 здоровых доноров. Средний возраст больных СКВ составлял 41,4±10,9 года, длительность процесса соответственно 11±4 года. Минимальная степень активности воспалительного процесса (А1) диагностирована у 41 больного (62,1%), умеренная (АII) - у 25 (37,9%). Острое течение заболевания встречалось у единичных больных (данные их обследования не включены в настоящую работу), подострое течение - у 38 (57,6%), хроническое - у 28 (42,4%). Суставной синдром при СКВ встречался у 49 больных (74,2%).

У больных СКВ, как при наличии, так и при отсутствии поражения суставов, продукция АФК, как Нф, так и Мн, по данным тестов спонтанной люцигенин- и люминолзависимой ХЛ была увеличена по сравнению с показателями группы контроля, характеризуясь выработкой широкого спектра АФК, в том числе высокотоксичных, с мощным гистодеструктивным действием. Индуцированные тесты ХЛ характеризовались вариабельностью, а коэффициенты активации фагоцитов при обеих формах красной волчанки, как правило, были уменьшены, указывая на снижение резервных функций циркулирующих фагоцитов.

При сравнении исследуемых показателей у больных СКВ в зависимости от наличия или отсутствия у них суставного синдрома констатировано снижение индуцированной люцигенинзависимой ХЛ Нф и спонтанной люминолзависимой ХЛ Нф у пациентов с поражениями суставов по сравнению с аналогичными данными в группе больных СКВ с отсутствием суставных поражений.

Проведенные исследования свидетельствуют о повышенной продукции АФК циркулирующими фагоцитами при СКВ, независимо от того, имеются или отсутствуют поражения суставов. Вместе с тем, развитие поражений суставов у больных СКВ сопровождается снижением некоторых показателей окислительного стресса нейтрофилов, что демонстрирует многоликость проявлений окислительного стресса фагоцитов в зависимости от клинических проявлений, в частности, от развития суставных поражений.

Работа представлена на II научную конференцию студентов, молодых ученых и специалистов с международным участием «Современные проблемы науки и образования», 19-26 февраля 2005г. Хургада (Египет)

Библиографическая ссылка

Романова Н.В. ПРОДУКЦИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ЦИРКУЛИРУЮЩИМИ ФАГОЦИТАМИ И СУСТАВНОЙ СИНДРОМ ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ // Успехи современного естествознания. – 2005. – № 3. – С. 116-116;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=8239 (дата обращения: 30.01.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания» 1

Настоящая обзорная статья рассматривает существующие в настоящее время представления о механизмах, которые лежат в основе генерации активных форм кислорода при пермеабилизации митохондриальных мембран. Рассмотрена роль ионов кальция и комплексов дыхательной цепи митохондрий. Обсуждается влияние уровня пиридиновых нуклеотидов, компонентов антиоксидантной системы, а также участие матриксных Са2+-активируемых дегидрогеназ. В литературе имеются данные, показывающие, что индукция митохондриальной Са2+-зависимой поры вызывает конформационные перестройки дыхательных комплексов I, II и III, что усиливает генерацию активных форм кислорода. Вход кальция в матрикс митохондрий может увеличивать скорости продукции активных форм кислорода за счет активации пируватдегидрогеназы и а-кетоглутаратдегидрогеназы, а также способствовать выходу цитохрома с в цитозоль при индукции митохондриальной поры. Выход глутатиона и восстановленных пиридиновых нуклеотидов через пору снижает антиоксидантную защиту матрикса митохондрий и увеличивает продукцию супероксид аниона и перекиси водорода. Явление всплеска активных форм кислорода, вызванного пермеабилизацией митохондрий, сопровождает различные патологические состояния, включая ишемию с последующей реперфузией, поэтому понимание молекулярных процессов, лежащих в его основе, необходимо для дальнейшей разработки способов его фармакологической коррекции.

активные формы кислорода

митохондриальная пора

дыхательная цепь митохондрий

1. Halestrap A.P., Richardson A.P. The mitochondrial permeability transition: a current perspective on its identity and role in ischaemia/reperfusion injury // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2015. Vol. 78. P. 129-141.

2. Brookes P.S., Yoon Y., Robotham J.L. et al. Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate triangle // American Journal of Physiology. Cell Physiology. 2004. Vol. 287 (4). P. 817-833.

3. Ruiz-Ramírez A., López-Acosta O., Barrios-Maya M.A., El-Hafidi M. Cell death and heart failure in obesity: role of uncoupling proteins // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016. Vol. 2016. P. 1-11.

4. Zorov D.B., Juhaszova M., Sollott S.J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release // Physiological Reviews. 2014. Vol. 94 (4). P. 909-950.

5. Andrienko T., Pasdois P., Rossbach A., Halestrap A.P. Real-time fluorescence measurements of ROS and in ischemic/reperfused rat hearts: detectable increases occur only after mitochondrial pore opening and are attenuated by ischemic preconditioning // PLoS ONE. 2016. Vol. 11 (12).

6. Korge P., John S.A., Calmettes G., Weiss J.N. Reactive oxygen species production induced by pore opening in cardiac mitochondria: the role of complex II // The Journal of Biological Chemistry. 2017. Vol. 292 (24). P. 9896-9905.

7. Korge P., Calmettes G., John S.A., Weiss J.N. Reactive oxygen species production induced by pore opening in cardiac mitochondria: The role of complex III // The Journal of Biological Chemistry. 2017. Vol. 292 (24). P. 9882-9895.

8. Batandier C., Leverve X., Fontaine E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I // The Journal of Biological Chemistry. 2004. Vol. 279 (17). P. 17197-17294.

9. Cadenas S. ROS and redox signaling in myocardial ischemia reperfusion injury and cardioprotection // Free Radical Biology and Medicine. 2018. Vol. 117. P. 76-89.

10. Chouchani E.T., Pell V.R., James A.M. et al. A unifying mechanism for mitochondrial superoxide production during ischemia-reperfusion injury // Cell Metabolism. 2016. Vol. 23 (2). P. 254-263.

11. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. Генерация активных форм кислорода митохондриями // Успехи биологической химии. 2013. Т. 53. С. 245-296.

12. Maklashina E., Sher Y., Zhou H.Z. et al. Effect of anoxia/reperfusion on the reversible active/de-active transition of NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) in rat heart // Biochimica et Biophysica Acta. 2002. Vol. 1556 (1). P. 6-12.

13. Grivennikova V.G., Kareyeva A.V., Vinogradov A.D. What are the sources of hydrogen peroxide production by heart mitochondria? // Biochimica et Biophysica Acta. 2010. Vol. 1797 (6-7). P. 939-944.

14. Chouchani E.T., Methner C., Nadtochiy S.M. et al. Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I // Nature Medicine. 2013. Vol. 19 (6). P. 753-759.

15. Imlay, J.A. A metabolic enzyme that rapidly produces superoxide, fumarate reductase of Escherichia coli // Journal of Biological Chemistry. 1995. Vol. 270. P. 19767-19777.

16. Siebels I., Drose S. Q-site inhibitor induced ROS production of mitochondrial complex II is attenuated by TCA cycle dicarboxylates // Biochimica et Biophysica Acta. 2013. Vol. 1827 (10). P. 1156-1164.

17. Quinlan C.L., Orr A.L., Perevoshchikova I.V. et al. Mitochondrial complex II can generate reactive oxygen species at high rates in both the forward and reverse reactions // Journal of Biological Chemistry. 2012. Vol. 287 (32). P. 27255-27264.

18. Grivennikova V.G., Kozlovsky V.S., Vinogradov A.D. Respiratory complex II: ROS production and the kinetics of ubiquinone reduction // Biochimica et Biophysica Acta. 2017. Vol. 1858 (2). P. 109-117.

19. Chouchani E.T., Pell V.R., Gaude E. et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS // Nature. 2014. Vol. 515. P. 431-435.

20. Lemarie A., Huc L., Pazarentzos E. et al. Specific disintegration of complex II succinate:ubiquinone oxidoreductase links pH changes to oxidative stress for apoptosis induction // Cell Death and Differentiation. 2011. Vol. 18 (2). P. 338-349.

21. Huang L.S., Cobessi D., Tung E.Y., Berry E.A. Binding of the respiratory chain inhibitor antimycin to the mitochondrial bc1 complex: a new crystal structure reveals an altered intramolecular hydrogen-bonding pattern // Journal of Molecular Biology. 2005. Vol. 351 (3). P. 573-597.

22. Vercesi A.E. The participation of NADP, the transmembrane potential and the energy-linked NAD(P) transhydrogenase in the process of Ca2+ efflux from rat liver mitochondria // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1987. Vol. 252 (1). P. 171-178.

23. Peng T.I., Jou M.J. Oxidative stress caused by mitochondrial calcium overload // Annals of the New York Academy of Sciences. 2010. Vol. 1201. P. 183-188.

24. Starkov A.A. An update on the role of mitochondrial α-ketoglutarate dehydrogenase in oxidative stress // Molecular and Cellular Neuroscience. 2013. Vol. 55. P. 13-16.

25. Nickel A.G., von Hardenberg A., Hohl M. et al. Reversal of mitochondrial transhydrogenase causes oxidative stress in heart failure // Cell Metabolism. 2015. Vol. 22 (3). P. 472-484.

26. Wei A.C., Liu T., Winslow R.L., O"Rourke B. Dynamics of matrix-free Ca2+ in cardiac mitochondria: two components of Ca2+ uptake and role of phosphate buffering // Journal of General Physiology. 2012. Vol. 139 (6). P. 465-478.

27. Denton R.M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions // Biochimica et Biophysica Acta. 2009. Vol. 1787 (11). P. 1309-1316.

28. Patterson S.D., Spahr C.S., Daugas E. et al. Mass spectrometric identification of proteins released from mitochondria undergoing permeability transition // Cell Death and Differentiation. 2000. Vol. 7 (2). P. 137–144.

29. Ott M., Robertson J.D., Gogvadze V. et al. Cytochrome c release from mitochondria proceeds by a two-step process // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002. Vol. 99 (3). P. 1259–1263.

30. Pereverzev M.O., Vygodina T.V., Konstantinov A.A., Skulachev V.P. Cytochrome c, an ideal antioxidant // Biochemical Society Transactions. 2003. Vol. 31. Pt. 6. P. 1312–1315.

Пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий опрeделяют как резкое увеличение ее проницаемости для ионов и растворов массой менее 1,5 kDa, приводящее к потере мембранного потенциала, набуханию митохондрий, разрыву их внешней мембраны и выходу апоптогенных факторов. Этот процесс происходит после открывания мегаканала, известного как Са 2+ -зависимая неспецифическая митохондриальная пора (mPTP) . Открывание mPTP, по-видимому, является ключевым фактором, вызывающим клеточную гибель и необратимые повреждения органов при многих патологических состояниях, таких как ишемия с последующей реперфузией, нейродегенеративные заболевания, мышечная дистрофия.

Главным активатором mPTP является кальций, при этом чувствительность к катиону многократно увеличивается при окислительном стрессе . Такие условия наблюдаются при ишемии/реперфузии, и считается, что они являются главным триггером открывания mPTP. Предположение о том, что основной всплеск активных форм кислорода (АФК) происходит при открывании поры и после, долгое время ставилось под сомнение, так как известно, что ее индукция приводит к разобщению митохондрий, а это, в свою очередь, снижает продукцию АФК . Однако группой Д. Зорова было обнаружено, что аккумулирование АФК в матриксе митохондрий сердечных миоцитов при фотоактивации тетраметилродаминовых производных запускает индукцию mPTP, которая сопровождается многократно усиленной продукцией («всплеском») АФК. Данное явление авторы назвали АФК-индуцированный выход АФК («ROS - induced ROS releas» (RIRR)) . Впоследствии появилось много работ, демонстрирующих всплеск АФК, вызванный индукцией mPTP . Выход АФК в цитозоль может активировать редокс-чувствительные ферменты, а также запускать сложный сигнальный ответ и генерацию АФК в соседних митохондриях. Данный процесс имеет важное физиологическое и патологическое значение, поскольку может индуцировать гибель не только старых и поврежденных митохондрий и клеток, но и здоровых. Вопрос о путях образования АФК при индукции mPTP несет важную научную и практическую значимость, но к настоящему моменту остается открытым.

Цель исследования

Произвести обзор существующих в современной литературе данных и гипотез о сайтах и механизмах продукции АФК при пермеабилизации внешней мембраны митохондрий.

Комплекс I дыхательной цепи митохондрий

Комплекс I (НАДН-убихинон оксидоредуктаза) является одним из главных мест продукции АФК в митохондриях. Считается, что основными сайтами генерации АФК в нем выступают флавинмононуклеотид НАДН-связывающего сайта (сайт I f), и убисемихинон коэнзим Q-связывающего сайта (сайт I q) . Продукция супероксида на сайте I f происходит во время прямого транспорта электронов, когда ФМН находится в сильно восстановленном состоянии и зависит от соотношения НАДН/НАД + в матриксе. Ингибитор коэнзим Q-связывающего сайта ротенон увеличивает продукцию супероксида, так как вызывает возвращение электронов на ФМН. Продукция супероксида на комплексе I также происходит во время обратного транспорта электронов, когда пул коэнзима Q полностью восстановлен .

При патологических условиях увеличение эффективности АФК-генерирующих сайтов комплекса I могут быть связаны с его конформационными перестройками. Открывание mPTP сильно снижает ротенон-чувствительную активность НАДН-убихинон редуктазы и увеличивает продукцию Н 2 О 2 в присутствии ≥50 µМ НАДН . НАДН-убихинон оксидоредуктаза характеризуется медленным переходом из активного состояния в неактивное и наоборот. Это предполагает большие конформационные перестройки комплекса, по крайней мере той его части, которая вовлечена в ротенон-чувствительное восстановление убихинона . Было показано, что комплекс I, выделенный из сердца крыс, подвергшегося 30-минутной аноксичной перфузии, переходил в неактивное состояние и возвращался к активному после реоксигенации . Авторы предположили, что эти конформационные перестройки могут быть связаны с генерацией АФК после того, как ткани сердца, подвергшиеся коронарной окклюзии, реоксигенируются. Переход комплекса в неактивное состояние сопровождается специфическим демаскированием Cys39 субъединицы ND3 . Было показано, что нитрозирующие соединения, обратимо модифицирующие данный цистеин, могут использоваться в качестве фармакологической защиты от генерации АФК при реперфузии .

Комплекс II дыхательной цепи митохондрий

Комплекс II, или сукцинат-убихинон оксидоредуктаза, является тетрамерным, содержащим железо-серные кластеры флавопротеином внутренней мембраны митохондрий. Он одновременно участвует в работе цикла Кребса и дыхательной цепи, осуществляя превращение сукцината в фумарат и восстанавливая убихинон до убихинола.

Возможность образования АФК флавином фумаратредуктазы E. coli (сайт II f) в присутствии низких концентраций дикарбоновых кислот впервые была показана в работе . Впоследствии продукция АФК была продемонстрирована на субмитохондриальных частицах митохондрий бычьего сердца и скелетных мышц . Ингибитор комплекса II атпенин А5 и ингибитор комплекса III стигмателлин, который блокирует окисление убихинола комплексом III, стимулируют продукцию АФК комплексом II в присутствии сукцината. Малонат, напротив, ингибирует генерацию АФК комплексом II, что указывает на то, что АФК образуются на полностью восстановленном флавиновом сайте II f , хотя не исключены и другие сайты . Зависимость продукции перекиси водорода от концентрации сукцината имеет колоколообразную форму: уровень перекиси растет с увеличением концентрации субстрата до 400 μМ, затем значительно снижается при миллимолярных концентрациях, обычно используемых для энергизации митохондрий. Причиной этого явления является то, что комплекс II генерирует АФК только тогда, когда его флавиновый сайт II f не занят дикарбоновыми кислотами . Cукцинат и другие интермедиаты цикла Кребса, которые взаимодействуют с сайтом связывания дикарбоновых кислот, могут ограничивать доступ к нему кислорода и, таким образом, подавлять продукцию АФК комплексом II. Уровень сукцината и фумарата в матриксе увеличивается во время ишемии/гипоксии, однако это не предотвращает образование АФК. Напротив, было показано, что аккумулирование сукцината во время ишемии сильно коррелирует с продукцией АФК и повреждениями при реперфузии . Авторы предположили, что главным источником АФК в данных условиях является обратный поток электронов через комплекс I . Однако, в условиях длительной ишемии, когда мембраны полностью деполяризуются, данный механизм вряд ли осуществим. Альтернативный механизм генерации АФК предполагает получение доступа кислорода к восстановленному сайту II f из-за снижения содержания дикарбоновых кислот в его непосредственной близости в результате ускорения выхода сукцината и фумарата из матрикса при индукции mPTP . Данный механизм требует ингибирования комплекса II на уровне восстановления убихинона либо ингибирования окисления убихинола комплексом III.

Конформационные перестройки комплекса II также могут способствовать всплеску АФК при пермеабилизации мембран. Было показано, что при понижении внутриклеточного рН, наблюдающегося при апоптозе, происходит диссоциация комплекса II: субъединицы сукцинатдегидрогеназы SDHA и SDHB, осуществляющие окисление сукцината до фумарата и перенос электронов через железо-серные кластеры, отделяются от сайта восстановления коэнзима Q сукцинат CoQ оксидоредуктазы (SQR) . Это приводит к ингибированию активности SQR, при этом сукцинатдегидрогеназная активность остается в норме. Такая диссоциация приводит к прямому одноэлектронному восстановлению кислорода железо-серным кластером комплекса II. И хотя известно, что низкий рН является ингибитором mPTP, тем не менее данный механизм всплеска АФК может иметь место при ишемии, когда происходит падение рН. В это время могут происходить конформационные перестройки комплекса II, и впоследствии, при реперфузии, когда рН восстанавливается до исходного уровня, открывается mPTP и наблюдается всплеск АФК, образуемых на диссоциированном комплексе.

Комплекс III дыхательной цепи митохондрий

Комплекс III (убихинол-цитохром с оксидоредуктаза) - еще один возможный сайт образования АФК. Данный белок осуществляет перенос электронов от убихинона на цитохром с в процессе функционирования так называемого Q-цикла. В ходе данного процесса происходит образование нестабильного семихинона, который может передавать электрон на кислород, образуя при этом супероксидный радикал. Однако в нормальных условиях такая реакция маловероятна, так как семихинон быстро окисляется цитохромом b. Резкое возрастание уровня супероксида происходит при ингибировании комплекса антимицином А, а также при ишемии длительностью более 30 минут . Одной из причин данного явления могут быть его конформационные перестройки, вызванные связыванием ингибитора . На изолированных митохондриях сердца было показано, что комплекс III, заингибированный с помощью антимицина A, генерирует значительное количество АФК в присутствии Mg 2+ и НАД + и в отсутствии экзогенных субстратов при индукции mPTP кальцием и аламетицином. Авторы показали, что в этих условиях продукция перекиси водорода относится к Mg 2+ -зависимой генерации НАДН малатдегидрогеназой. Продукция H 2 O 2 ингибировалась стигмателлином и пирицидином, что указывает на важность НАДН-зависимого восстановления убихинона для генерации АФК в данных условиях. Эти данные подтверждают гипотезу, согласно которой во время ишемии при индукции mPTP увеличение концентрации Mg 2+ , НАД + в матриксе активирует малатдегидрогеназу, которая восстанавливает НАД + , используя малат, концентрация которого повышается вследствие увеличения уровня сукцината и фумарата. Восстановленные эквиваленты поступают на заингибированный комплекс III, в результате чего происходит всплеск АФК .

Роль пиридиновых нуклеотидов в генерации АФК

Раннее было показано, что окисление НАД(Ф)Н матрикса митохондрий предшествует открыванию mPTP . Кроме того, индукция поры приводит к утечке пиридиновых нуклеотидов в цитозоль клетки . Данное изменение баланса НАД(Ф)Н должно влиять на продукцию АФК при пермеабилизации митохондрий. Зависимость генерации АФК от концентрации НАДН была исследована группой А. Виноградова. Было показано, что максимальная продукция супероксида достигает максимума при концентрации НАДН 10-50 μМ, при миллимолярных концентрациях продукция радикала тормозится . Так как физиологические концентрации НАДН/НАД + пары матрикса находятся в миллимолярном диапазоне, то вклад комплекса I в генерацию АФК в нормальных условиях может быть незначительным. Было обнаружено, что в пермеабилизованных митохондриях происходит высокая, зависящая от отношения НАД(Ф)Н/НАД(Ф) + и стимулируемая ионами аммония продукция Н 2 О 2 . При этом выход перекиси водорода был нечувствителен к дикумаролу (ингибитору НАДН-хинон оксидоредуктазы) и НАДН-OH (ингибитору комплекса I), что указывает на матриксную локализацию H 2 O 2 -генерирующего сайта. Исследуемый белок обладал НАДН:липоамид оксидоредуктазной активностью и был идентифицирован как дигидролипоамиддегидрогеназа . Данный белок является важным компонентом (так называемым Е3 компонентом) двух ФАД-cодержащих митохондриальных ферментов: а-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса и пируватдегидрогеназного комплекса. Согласно данным, полученным на очищенных комплексах и на изолированных митохондриях , компонент Е3 отвечает за продукцию супероксида и перекиси водорода. Было показано, что пермеабилизованные митохондрии сердца крыс, окисляющие НАДН, продуцируют около 50% перекиси водорода за счет работы комплекса I, а остальные 50% приходятся на долю дигидролипоамиддегидрогеназы .

Восстановленные формы пиридиновых нуклеотидов не только поставляют электроны в дыхательную цепь митохондрий, но также регулируют редокс-статус матрикса через про- и антиоксидантные белки. Одним из таких белков является глутатион, который, совместно с НАДФН, является субстратом антиоксидантных белков глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы . При открывании mPTP может происходит выход НАДФH и глутатиона, что вызывает накопление Н 2 О 2 . Более того, в данных условиях из-за падения мембранного потенциала никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа (НАДФН- трансгидрогеназа) не может поддерживать высокий уровень восстановленного НАДФ + , что способствует окислительного стрессу . В физиологических условиях данный фермент осуществляет регенерацию НАДФН в прямой реакции, используя НАДН в качестве субстрата. Эта реакция энергетически выгодна, поскольку трансгидрогенирование между НАДН и НАДФН связано с протонным градиентом вдоль внутренней мембраны. Однако в патологических условиях она может протекать в обратном направлении, регенерируя НАДН для синтеза ATP за счет утилизации НАДФН . Таким образом, антиоксидантная защита, связанная с уровнем восстановленности НАДФ + , падает, что способствует продукции H 2 O 2 .

Роль кальция в генерации АФК

Известно, что увеличение концентрации кальция в матриксе митохондрий запускает индукцию mPTP, при этом чувствительность поры к катиону увеличивается при окислительном стрессе, повышением уровня фосфата и снижением пула адениновых нуклеотидов . Концентрация ионов кальция в матриксе митохондрий находится в пределах примерно 10 nМ. При этом их кальциевая емкость очень высока, изолированные митохондрии способны секвестрировать более 1M кальция из среды, поддерживая концентрацию свободного кальция в микромолярных пределах, в которых происходит регуляция Ca 2+ -зависимых ферментов . К таким ферментам относятся пируватдегидрогеназа и а-кетоглутаратдегидрогеназа. Их активация приводит к усилению дыхания и синтеза АТФ и, вероятно, к повышению продукции АФК .

В процессе пермеабилизации митохондриальных мембран происходит выход из межмембранного пространства и матрикса примерно 100 белков, в том числе таких важных элементов антиоксидантной защиты, как глутатион и цитохром с .

Цитохром с является положительно заряженным белком, который связан с кардиолипином на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий, а также с дыхательными комплексами III и IV. Было показано, что выход цитохрома с является двухступенчатым процессом, включающим отсоединение белка от внутримембранных связывающих сайтов и последующую его транслокацию через внешнюю мембрану . Ca 2+ может усиливать диссоциацию цитохрома с от внутренней мембраны, так как является его конкурентом за связывание с отрицательно заряженным кардиолипином. Это способствует выходу цитохрома с в цитозоль при индукции mPTP. Более того, АФК, образуемые при пермеабилизации мембран, могут вызывать окисление кардиолипина, приводящее к изменению его физических свойств, что также может усиливать выход цитохрома с из митохондрий и способствовать еще большей генерации АФК. Пониженный уровень белка замедляет транспорт электронов от комплекса III к комплексу IV и, таким образом, увеличивает продукцию АФК в Q-цикле. Кроме того, цитохром с сам по себе является эффективным антиоксидантом, способным эффективно восстанавливаться супероксид анионом . Таким образом, повышение концентрации кальция в митохондриях оказывает стимулирующее влияние на АФК-продуцирующие ферменты матрикса и приводит к падению антиоксидантной защиты, тем самым увеличивая общий уровень АФК, генерируемый митохондриями.

Заключение

Митохондрии являются одновременно потенциальным источником и мишенью действия АФК, приводящим к потере митохондриальных функций и, как следствие, к необратимому повреждению клеток при многих патологических процессах. Важную роль при этом играет mPTP, индукция которой может приводить к мощной генерации АФК, оказывающих повреждающее действие на соседние органеллы и целые клетки. В настоящее время причины данного явления слабо изучены, хотя в литературе имеется несколько гипотез. Предполагается, что в основе всплеска АФК могут лежать конформационные перестройки комплексов дыхательной цепи, активация дегидрогеназ матрикса в результате действия Са 2+ , изменение баланса НАД(Ф)Н/НАД(Ф) + матрикса и истощение антиоксидантной системы. Дальнейшее исследование механизмов и сайтов продукции АФК при индукции mPTP представляется необходимым, поскольку их точное определение позволит разработать способы их регуляции для предупреждения развития многих патологических состояний организма.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 17-75-10122.

Библиографическая ссылка

Харечкина Е.С., Никифорова А.Б. МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕРАЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИ ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 4.;
URL: http://сайт/ru/article/view?id=27719 (дата обращения: 30.01.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

-- [ Страница 2 ] --

Рис.1. Наиболее частые патологические состояния у мужчин из бесплодных пар с гиперпродукцией АФК.

В целом, гиперпродукция АФК, по нашим данным, имеется у 38,2% пациентов с различными нарушениями качества спермы. Среди мужчин с гиперпродукцией АФК мы чаще всего выявляли варикоцеле (38,9% случаев) и хронический бактериальный простатит в фазе активного воспаления (25,1% случаев); у 8,9% мужчин – кисты в придатках, у 1,2% - отсутствие одного или обоих семявыносящих протоков.

В 52,2% случаев на фоне гиперпродукции АФК мы обнаруживали аутоиммунные реакции против сперматозоидов, сопровождающиеся выработкой АСАТ (рис.1).

На фоне гиперпродукции АФК нормоспермия выявлена в 19,3% случаев. Таким образом, нами установлено, что оксидативный стресс в 80,7% случаях сопровождался ухудшением качества спермы. Причем чаще всего наблюдалась астенозооспермия – 71,4% случаев, затем тератозооспермия – 36,3%, олигозооспермия - 28,3%, пиоспермия – 21,3%, иммунное бесплодие, когда антителами покрыты более половины подвижных сперматозоидов, – 10,6%; в 5% случаев – азооспермия. Следует отметить, что обычно имело место сочетание нескольких диагнозов. Нарушение акросомальной реакции на фоне оксидативного стресса отмечено более чем в половине всех случаев. Учитывая высокую частоту встречаемости отдельных патологических состояний у мужчин из бесплодных пар, актуальной задачей явилась необходимость выяснить степень риска развития оксидативного стресса на фоне различных этиопатогенетических факторов (рис.2).

Нами установлено, что инфекционно-воспалительные заболевания мужских репродуктивных органов, в частности, хронический бактериальный простатит, приводят к оксидативному стрессу сперматозоидов в 64,1% случаев, относительный риск - 2,9. На фоне иммунного бесплодия абсолютный риск оксидативного стресса составляет 40,2-71,0%, относительный - 1,5-2,9 (в зависимости от количества АСАТ). При варикоцеле абсолютный риск оксидативного стресса сперматозоидов составил 29,3-68,1%, относительный – 1,6-2,6 соответственно.

Таким образом, наиболее значимыми причинами развития оксидативного стресса явились хронический бактериальный простатит в фазе активного воспаления, аутоиммунные реакции против сперматозоидов и варикоцеле. Эти патологические состояния наиболее часто диагностировались при мужском бесплодии, и на их фоне отмечался высокий риск развития оксидативного стресса.

Мы изучили особенности оксидативного стресса в группах с различными причинами снижения фертильности. Нами установлено, что при варикоцеле (n=294) продукция АФК составила 0,48+0,40 мВ/с при индивидуальном разбросе значений от 0,01 до 66,15 мВ/с, что в 1,9 раза выше, чем у фертильных пациентов при отсутствии АСАТ и в 8 раз - при наличии аутоиммунных реакций.

Рис.2. Абсолютный риск оксидативного стресса сперматозоидов при различных этиопатогенетических факторах мужского бесплодия . Примечание: *** - различия по сравнению с группой фертильных мужчин достоверны по критерию ХИ-квадрат с p<0,001

В то же время корреляционный анализ не обнаружил взаимосвязи между выраженностью варикоцеле, с одной стороны, и уровнем АФК, в сперме - с другой (R=-0,004; gamma=-0,004; t=-0,003; р>0,05).

Нами проведен анализ особенности продукции АФК в эякуляте мужчин при различных формах варикоцеле. Получили, что гиперпродукция активных радикалов при субклинической форме расширения вен семенного канатика отмечалась в 31,2% случаях, при первой – 33,9%, при второй – 25,5%, 42,9% - при третьей. Таким образом, статистически значимых различий в частоте случаев гиперпродукции активных форм кислорода не выявлено (p>0,05).

Исходя из полученных нами данных, проведение УЗИ органов мошонки является обязательным при обследовании мужчин из бесплодных пар с целью вывления субклинических форм варикоцеле. Установленный диагноз варикоцеле является абсолютным показанием для определения уровня АФК.

На фоне гиперпродукции АФК при варикоцеле показано, по нашему мнению, оперативное лечение вне зависимости от степени варикоцеле.

При одинаковой степени расширения вен семенного канатика продукция АФК возрастала с увеличением продолжительности бесплодия (p<0,04-0,01); в среднем по группам у пациентов с варикоцеле степенью +1 при продолжительности бесплодия от 12 до 36 мес. она составляла 0,39+0,23 мВ/с, при бесплодии больше 36 мес – 0,64+0,45 мВ/с (p<0,05). Исходя из этого, прогноз оперативного лечения в раннем возрасте в плане восстановления фертильности более благоприятный, а выжидательная тактика ведения пациентов с варикоцеле не является обоснованной, учитывая высокий риск оксидативного стресса.

На фоне хронического простатита (n=130) нами установлена прямая зависимость продукции активных радикалов кислорода от количества лейкоцитов в секрете простаты (R=0,24; р=0,04). При повышении числа лейкоцитов в секрете простаты пиоспермия наблюдалась в 36,1% случаев. Зависимость продукции АФК от концентрации в сперме лейкоцитов (R=0,29; p<0,00001) сильнее, чем от содержания лейкоцитов в секрете простаты.

Пациенты с диагнозом «пиоспермия» отличались высоким содержанием АФК в сперме: в среднем по группе продукция составляла 9,81+/-25,56 мВ/с (при выбраковке значений +3S - 1,15+1,34 мВ/с) с индивидуальным разбросом от 0,07 до 153,50 мВ/с; медиана – 0,925 мВ/с, диапазон невыпадающих значений – от 0,07 до 9,52 мВ/с, что существенно больше (3,9 раз), чем у фертильных мужчин (p<0,001).

Значимая корреляция имеется между концентрацией в сперме лейкоцитов и выраженностью бактериоспермии (R=0,23; p=0,033), выраженностью бактериоспермии и продукцией АФК (r=0,35; p<0,01).

На основании полученных данных нами установлена положительная взаимосвязь между продукцией АФК и агглютинацией сперматозоидов у мужчин из бесплодных пар с патозооспермией. Причем при исключении образцов с пиоспермией коэффициент корреляции заметно снижался: R=0,13 (p>0,05), Gamma=0,30 (p=0,05).

Исключение из анализа образцов с концентрацией сперматозоидов менее 10 млн/мл и выпадающих значений (+2S) позволило более точно определять продукцию АФК и активность аутоиммунных реакций. При этих условиях у мужчин с хроническим простатитом, сопровождающимся пиоспермией, продукция АФК в 8,8 раз больше, чем у фертильных, и наблюдается более выраженная (R=0,44), чем для всей выборки, взаимосвязь между содержанием в сперме АФК и лейкоцитов.

Роль воспалительного процесса в повышении продукции АФК в сперме подтверждают результаты антибиотикотерапии хронического простатита (табл. 1). Показано, что уже через 2 недели лечения на фоне снижения количества лейкоцитов в секрете простаты на 39,1% (p<0,01) и на 35,2% в сперме (p>0,05) происходит более чем двукратное снижение продукции АФК (-58,1%; p<0,05). Одновременно происходит улучшение жизнеспособности (p<0,05) и подвижности (p<0,05), нормализация акросомальной реакции сперматозоидов в виде уменьшения доли гамет, преждевременно утративших целостность акросомальной мембраны (p<0,05), а у пациентов с АСАТ – снижение процента MAR-позитивных сперматозоидов (p<0,01).

Таким образом, анализ данных обследования мужчин из бесплодных пар с простатитом показал, что повышенное количество лейкоцитов в сперме на фоне простатита служит основным источником гиперпродукции активных форм кислорода, приводит к оксидативному стрессу и изменению функциональных свойств сперматозоидов.

У половины (51,5%) пациентов из бесплодных пар с пиоспермией обнаружены АСАТ, но только у 9,2% они покрывали более 50% подвижных сперматозоидов.

Корреляция между концентрацией лейкоцитов в сперме и процентом АСАТ-позитивных подвижных сперматозоидов отсутствует (R=0,0; p>0,05).

Нами установлено, что продукция свободных радикалов больше зависит от количества антител на сперматозоидах (R=0,81), чем от процента подвижных МАР-позитивных гамет (R=0,44), определяемого с помощью метода ПЦМ, который мы рекомендуем как более точно характеризующий активность аутоиммунных процессов в эякуляте.

Мы проанализировали особенности продукции АФК при различных формах патоспермии. Корреляционный анализ показателей спермограммы пациентов с тератозооспермией не обнаружил зависимости между процентом патологических форм и продукцией АФК. Однако имеется взаимосвязь между процентом сперматозоидов с измененной шейкой и продукцией АФК и отсутствием АСАТ: r=0,2; p<0,01. Также в этой выборке обнаружена положительная корреляция между продукцией АФК и процентом сперматозоидов, спонтанно претерпевших акросомальную реакцию: r=0,24; p<0,05 для группы пациентов с нормальной концентрацией сперматозоидов и лейкоцитов.

Повышение уровня АФК при тератозооспермии может объясняться выбросом активных радикалов с повреждением мембран сперматозоидов, задержке цитоплазмы, и, наоборот, что вероятней всего, является следствием продукции морфологически дефектными гаметами. При этом нарушается нормальное течение акросомальной реакции и происходит апоптоз гамет с повреждениями целостности их ДНК (Aitken et al., 1989; Saleh et al., 2003; Jedrzejczak et al., 2005; Deepinder F., 2008).

Морфологически измененные сперматозоиды с дефектным ДНК обладают низкой способностью оплодотворять яйцеклетку, а в случае наступления беременности высок риск генетических патологий плода.

Таблица 1

Изменения продукции активных факторов кислорода, показателей спермограммы, акросомальной реакции, процента АСАТ-позитивных сперматозоидов и секрета простаты при антибиотикотерапии хронического простатита у мужчин из бесплодных пар (М + SE)

Показатели	Мужчины с простатитом (n=48)
	До лечения	После 2 нед леч е ния
Активные формы кислорода, мВ/с	22,1+6,91	9,28+4,63**
Лейкоциты спермы, х106/мл	2,07+0,52	1,34+0,58
Подвижные сперматозоиды категории А, %	14,1+1,53	18,3+1,7*
Живые сперматозоиды, %	73,0+2,7	77,6+2,7*
Лейкоциты секрета простаты, единиц в поле зрения	27,6+4,6	16,8+3,8**
MAR IgG-позитивные сперматозоиды, %	31,8+6,93	26,1+6,51**
Акросомальная реакция преждевременная, %	23,3+2,57	18,1+2,21*
Акросомальная реакция индуцированная, %	32,9+3,14	31,7+2,83
Индуцируемость акросомальной реакции, %	8,8+2,6	13,6+2,3

Семенная жидкость мужчин, больше известная как сперма, в медицине носит название эякулят. Это природная жидкость, выделяемая семенниками, имеющая характерную слизистую структуру, вязкая и непрозрачная.

Выделение эякулята происходит вследствие сексуального возбуждения при половой близости или мастурбации. Эякулят отличается специфическим запахом, похожим на аромат каштана, светлый, почти белый цвет.

Вкус жидкости зависит от продуктов, употребляемых мужчиной, и общего состояния его здоровья. У здоровых представителей мужского пола она имеет слегка соленый вкус с горьковатым оттенком. Как и любая жидкость человеческого тела, эякулят может быть исследован в лабораторных условиях для оценки состояния здоровья пациента.

Анализ эякулята проводится двумя способами: бактериологический посев и спермограмма.

Основные характеристики спермы

При половом акте или мастурбации выделяется небольшое количество семенной жидкости, объем которой зависит от нескольких факторов. Согласно медицинским нормам, он должен находиться в пределах от двух до десяти миллилитров.

Однако у взрослых мужчин количество спермы может быть меньше, снижается ее объем и с каждым половым актом, следующим с непродолжительными временными перерывами. Поэтому врачи чаще ориентируются на границы нормы от двух до пяти миллилитров.

Очень часто представители сильного пола принимают снижение количества выделяемой спермы за тревожный признак, свидетельствующий об ухудшении мужской силы и здоровья. В молодом возрасте мужчины полагают, что чем больше спермы выделяется при семяизвержении, тем больший эффект он производит на сексуальную партнершу.

На самом деле, количество выделяемого эякулята и его качество – две совершенно разные вещи. Не всегда большой объем спермы является показателем ее высокой фертильности. А ведь главное в эякуляте – это количество здоровых и активных сперматозоидов, способных достичь яйцеклетки и оплодотворить ее.

Такая оплодотворяющая способность спермы рассчитывается в лабораторных условиях. Согласно исследованиям, в 1 миллилитре спермы должно находиться от 20 до 25 миллионов здоровых сперматозоидов.

Сам эякулят состоит из семенной плазмы и форменных элементов. К последним относятся не только сперматозоиды, но и гоноциты. Семенная плазма – это основа спермы, отвечающая за ее правильную структуру. Выделяется она в том случаем, если все внутренние мужские органы работают правильно и слаженно. Оценить, насколько семенная жидкость здорова, можно, лишь проведя лабораторные анализы.

Посев эякулята и спермограмма назначаются пациентам в следующих случаях.

1. Бесплодие. Этот диагноз ставится семейным парам, которые в течение года активной половой жизни не смогли самостоятельно зачать ребенка.
2. В качестве обследования перед проведением процедуры экстракорпорального оплодотворения.
3. При подозрении на возможную утрату свойств спермы вследствие перенесенных заболеваний или травм половых органов (инфекционные заболевания, гормональный дисбаланс, варикоцеле и т. д.).
4. В качестве профилактического обследования по желанию пациента.
5. Исследование эякулята входит в состав обязательных диагностик при планировании зачатия малыша семейной парой.

Однако основная задача данного исследования – это определение причины, мешающей мужчине стать отцом, то есть бесплодия. Помогает исследование эякулята выяснить и причины снижения объема выделяемой жидкости, уменьшения количества активных сперматозоидов.

Определят данные анализы возможные воспаления и инфекции, поразившие пациента, что поможет начать не только лечение бесплодия, но и других недугов, а также увеличить количество активных спермиев.

Бакпосев семенной жидкости – одна из наиболее часто выполняемых диагностик, назначаемых для исследования мужского здоровья. Диагноз «бесплодие» все чаще ставится вполне здоровым молодым людям, которые на другие аспекты здоровья не жалуются. Что же приводит к развитию данного недуга?

В первую очередь, это вина самого пациента. Нездоровый образ жизни, вредные привычки, неправильное питание, - все это приводит к гормональному дисбалансу организма, в результате которого снижается количество здоровых сперматозоидов и их активность.

Неразборчивость в половых связях, пренебрежение правилами контрацепции и, как следствие, заболевания половой системы, также влияют на возможность мужчины зачать ребенка.

К этим факторам можно добавить плохую экологическую обстановку, постоянные стрессы и высокое психоэмоциональное напряжение, отсутствие минимальных физических нагрузок, вредные рабочие условия.

Благодаря анализам, врач сможет установить точную причину того, почему не происходит зачатие природным путем, а также назначит лечение, которое устранит данные факторы, повысит качество спермы и восстановит природные функции мужского здоровья. Обычно такое лечение включает ряд мероприятий: прием медикаментов, физиотерапевтические процедуры, изменение образа жизни.

Задача бактериологического посева – определить причины, по которым не происходит зачатие, выявить возможные воспаления, инфекционные болезни и другие дисфункции репродуктивных систем пациента.

Бактериологический посев эякулята и спермограмма

При проведении данного исследования можно выявить вредные микроорганизмы, присутствующие в эякуляте, а также выяснить чувствительность патогенной микрофлоры к определенным видам антибиотических препаратов.

Бактерии и инфекции, присутствующие в семенной жидкости, могут стать причинами изменения структуры эякулята, то есть изменения его вязкости.

Такое явление носит название вискозипатия. Причины ее появления: простатит, варикоцеле, орхит, воспалительные процессы в мочеполовых органах мужчины. Нередки случаи, когда врач не может установить точную причину данных изменений, тогда диагноз звучит как «идиопатическая вискозипатия».

Для уточнения диагноза совместно с бакпосевом проводится и спермограмма, которая подтверждает или опровергает «синдром вязкой спермы». При данном явлении, в организме возникают нарушения работы внутренних половых органов, в результате чего процессы, ответственные за разжижение семенной жидкости, протекают неправильно.

Если эякулят слишком вязкий, плотный, то спермии не могут двигаться в нем свободно, скорость их движения снижается, они становятся неспособными достичь маточных труб и более восприимчивыми к воздействию окружающих факторов, среды влагалища и матки.

Заметить такие нарушения без клинических исследований невозможно, так как объем спермы может оставаться прежним, а вот оплодотворительная способность– очень низкой. В норме вязкость эякулята не должна быть выше двух сантиметров. Превышение становится основанием для постановки диагноза «вискозипатия».

При проведении спермограммы учитываются такие данные семенной жидкости и параметры, как и при других обследованиях, а также некоторые дополнительные характеристики: качество спермиев, наличие или отсутствие эритроцитов (в норме их быть не должно), наличие или отсутствие слизистых форм жидкости, а также биохимические параметры.

Когда назначается бактериологический посев

Бакпосев спермы проводится параллельно с изучением характеристик простатического секрета. Назначаются эти процедуры всем пациентам, у которых врач подозревает наличие воспалительного процесса.

Обследование необходимо для того, чтобы выявить инфекционные заболевания и назначить лечение, способное остановить данные процессы и не допустить их переход в острые или хронические стадии.

В ходе исследования выявляются патогенные микроорганизмы, способные спровоцировать недуги в сфере урологии или вызвать венерические заболевания. Это одно из высокочувствительных исследований, необходимое не только для выбора тактики медикаментозной терапии, но и для контроля проводимого лечения.

Нативный эякулят и активные формы кислорода

Один из новейших методов исследования семенной жидкости – изучение нативных (чистых, необработанных) сперматозоидов. Такая методика позволяет изучить эякулят на субклеточном уровне, в результате чего определяются различные аномальные явления, присутствующие в клетках сперматозоидов.

Для изучения берутся «живые» спермии, излучающиеся под микроскопом, который позволяет их увеличить в 15 тысяч раз.

Чтобы провести исследование правильно, семенную жидкость лучше всего сдавать непосредственно в самой клинике, где будут проводиться исследования. С момента сбора до момента начала лабораторной диагностики должно пройти не более одного часа. Еще одно требование перед сдачей данного анализа – полный половой покой за несколько дней до посещения лаборатории.

Как и при других исследованиях, данный анализ изучает как самих сперматозоидов, так и семенной секрет. Эти параметры должны соответствовать здоровым нормам. Так, щелочной баланс должен быть в пределах от 7,2 до 7,8 рН, объем жидкости – не менее двух мл. Количество сперматозоидов в 1 мл – не менее 20 млн., причем не менее 50% из них должны иметь поступательное движение.

Общий объем клеток с нормальным морфологическим строением не должен быть менее трети от всего количества.

Неактивные и поврежденные сперматозоиды не должны составлять более половины объема полученной семенной жидкости. В случае, если хотя бы один из данных параметров нарушен, можно говорить о мужском бесплодии.

Бывают ситуации, когда в нативном эякуляте наблюдается избыточная продукция активных форм кислорода (АФК). АФК являются основными причинами окислительных процессов в семенной жидкости. Причинами такого явления могут быть болезни половой системы, аутоиммунные расстройства организма, воздействия окружающей среды.

Также продукция АФК увеличивается с возрастом пациента, при хронических недугах эндокринной системы, при тяжелых физических нагрузках. Все это влияет на объем спермиев в эякуляте, а отсутствие их необходимого количества ведет к бесплодию.

Как подготовиться к сдаче анализа

Чтобы провести обследование правильно и получить максимально точные результаты, следует ответственно подготовиться к сдаче эякулята. Сбор его проводится только в специальные стерильные одноразовые контейнеры, которые выдаются в клинике, проводящей подобные анализы.

Запрещено использовать для сбора любую стеклянную тару из-под пищевых продуктов, презервативы, пластиковые пакеты и т. д.

Очень важно отметить на контейнере не только дату, когда был собран эякулят, но и точное время. От этого будет зависеть точность некоторых показателей, изучаемых в процессе диагностики. Для проведения анализа стоит отдать предпочтение клинике, рекомендованной лечащим врачом.

Как только эякулят собран, его следует немедленно отвезти в лабораторию. Нежелательно хранить собранный биоматериал. Но если такой возможности нет, контейнер не нужно ставить в холодильник.

Оптимальная температура хранения – от 20 до 40 градусов. Отсутствие должных условий хранения может привести к появлению ложных результатов. Также за несколько дней до проведения анализа стоит отказаться от интимных отношений.

Результаты анализов обычно получают в течение суток с момента сдачи биоматериала в лабораторию. Полученный бланк с личными данными, основными параметрами, нормами и изученными показателями выдается на руки пациенту.

Расшифровку полученных данных проводит только лечащий врач, который дал направление на проведение диагностики. Он же устанавливает окончательный диагноз и назначает лечебную терапию. Иногда кроме врача-репродуктолога, может потребоваться консультация и других специалистов: уролога, венеролога, хирурга, эндокринолога.

По результатам проведенных лабораторных исследований врач установит точную причину бесплодия и назначит лечение, призванное увеличить количество активных и здоровых спермиев в семенной жидкости. Но кроме приема медицинских препаратов и различных физиопроцедур, лечение должно включать в себя и другие параметры.

Увеличить качество спермы поможет соблюдение здорового образа жизни. Отказ от спиртных напитков и сигарет помогает улучшить результаты анализов в самое короткое время.

Эякулят станет более качественным, если в жизнь пациента войдут даже минимальные физические нагрузки: утренняя зарядка, прогулки, отказ от лифта и т. д.

Если есть возможность посещать фитнес-центры, стоит отдать предпочтение тренировкам, которые не приведут к чрезмерному перегреву организма. Это может быть плавание, йога, упражнения на растяжку.

Увеличить количество активных сперматозоидов способны и перерывы в работе, если она связана с длительным сидением на одном месте. Регулярные перерывы каждый час, при которых пациент сможет встать и походить по комнате, позволят не только дать отдых глазам, но и улучшить кровообращение в тазу, что напрямую влияет на состояние мужского здоровья.

Если встать возможности нет, можно выполнить несколько упражнений сидя.

Важно правильно и регулярно питаться, отказаться от перекусов, особенно вредной едой. Чтобы эякулят был более качественный, основу рациона должны составлять белковые и растительные продукты, а также рыба и кисломолочные напитки. Питаться нужно регулярно, часто и небольшими порциями.

Стоит избегать излишних стрессов и эмоциональных перенапряжений, которые также напрямую влияют на состояние мужского здоровья.

Увеличить объем сперматозоидов поможет отказ от посещения мест, в которых наблюдается повышение температурного режима: баня, пляж. Нижнее белье, особенно в летний период, должно быть только из натуральных тканей.

Синтетика увеличивает температуру тела в паху, что снижает качество спермы.

Такие простые меры помогут дополнить лечение, назначенное лечащим специалистом, в более короткие сроки улучшить результаты анализов и быстрее зачать долгожданного малыша.

Врач сексопатолог-андролог 1 категории. Глава Херсонского отделения Украинской ассоциации планирования семьи.